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免疫组化常见问题及处理方法
发布日期: 2018-08-20    浏览次数: 240    新闻编辑: 

杂信号-非特异性架色

由于切片、内源性IgG、Fc受体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素的存在等原因,同时组织在处理过程中如高温修复也会使更多的內源性生物素暴露,造成染色组织上会出现非抗原部位的非特异性染色、边缘效应等杂信号。原因分析如下:

全片着色

1.是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是,并不是每一种组织均需要进行此步骤,但对于内源性酶或生物素丰富的组织,如肝脏、肾脏等,需考虑此原因。

2.封闭液的使用。是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸所造成的非特异性背景染色的消除方法是以二抗动物的非免疫血清(正常血清),用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片,以封闭吸附位点。另外,取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭,效果也不错。同时正常血清也封闭了内源性Fc受体、內源性IgG的非待异性结合位点。

3.所选择的抗体是否符合试验要求。因抗体不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色可通过使用高纯度、高效价的抗体,或者使用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

4.一抗的使用浓度是否过高。过高常常会出现整张片子着色。

5.冲洗是否充分。冲洗液体积及冲洗时间均需达到要求,应严格执行操作规程。

6.DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间过长和配制方式不正确可以产生某些背景颜色。

7.检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

8.组织抗原弥散:染色结构不清,主要见于组织切片固定不及时造成。

10.脱蜡不完全,粘片剂过多。

部分着色

1.局部着色:切片捞片时应一步到位,避免产生气泡,组织局部鼓起。

2.明阳着色:切片未放平,滴加试剂偏向一侧。


信号弱一弱阳性结

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性,除了考虑上述因素外,还应考虑:

1.标本的固定方式:不适当的固定剂,固定时间过长或过短,固定温度过高,都会影响到所检观的抗原的数量和质量。

2.抗原修复方式不当:由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用,必须用抗原热修复或酶消化等方法使抗原暴露,至于使用哪一种方法,应参照生产厂家的说明,同时结合标本的具体情况而定。

3.第一抗体效价太低或被过度稀释,或者孵育的温度/时间不合适也可导致弱阳性结果。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围,但是由于使用者的标本来自各种组织,处理过程也不尽相同,所以应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度视试,找出最佳的使用浓度。

4.切片上如遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

5.孵育时切片是否放置水平,否则会导致抗体流失。

无信号一阴性结果

1.真阴性结果:组织或细胞不表达抗原,无法检测到相关信号;或表达抗原太低:所使用检测系统不足以达到检测所需要的灵敏度。

2.假明性结果:

(1)染色前错误:切片时选错蜡块和选错切片,这种情况可用H&E染色验证。

(2)染色中错误:

①确认是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗、底物等。

②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入,是否在足够高的温度条件下孵育了足够的时间。

③复查抗体的标签确认是否使用了正确的抗体,以及所用的检测系统是否和一抗匹配,这点是非常重要的。比如,如果一抗是兔来源的抗体,二抗一定要用抗兔的二抗来匹配:或一抗是小鼠的IgM一抗,二抗必须是抗小鼠的IgM(不是IgG)二抗。

④检查抗体的有效期和保存条件,尤其是标记了酶或荧光素的抗体。现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存,应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价。

⑤检查抗体稀释度及所使用的抗体稀释液是否合适。

③确定组织或细胞标本的储存条件。

②检查底物溶液,最简单的检则方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物的因素。需要主意的是,有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完,否则会失效。

③检查冲洗液是否和反应试剂匹配,冲洗液的pH值也很重要,与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

②检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配。荧光素染色封片要选用水溶性封片剂,AEC, AP Red/Fast Red和其它水溶性染料不能用二甲苯有机溶剂透明。


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